流式-JC-1（培养细胞）

一、实验简介

线粒体膜电位的下降是细胞凋亡早期的一个标志性事件。JC-1是一种理想的用于检测线粒体膜电位的荧光探针，可以检测细胞、组织或纯化的线粒体膜电位。其原理是，当线粒体膜电位较高时，JC-1聚集在线粒体基质中，形成聚合物，488nm激发时的***发射波长为590nm，可以产生红色荧光，在流式上表现为FL1和FL2双阳性；当线粒体膜电位较低时，JC-1不能聚集在线粒体基质中，此时JC-1为单体，488nm激发时***发射波长为527nm，可以产生绿色荧光，形成流式图汇总所有细胞FL1为阳性。凋亡细胞则大多为FL1单阳性。不同荧光颜色的转变反应线粒体膜电位的变化，常用红绿荧光的相对比例衡量线粒体去极化的比例。

二、流式JC-1实验步骤

1、收集细胞：细胞悬液转入离心管中，1000rpm离心5min收集细胞,弃上清。

2、PBS洗涤细胞：加入3ml 4℃预冷的PBS完全重悬细胞，1000rpm离心5min，弃上清。沉淀震荡混匀。

3、细胞计数：移取10微升在血细胞计数仪上进行细胞计数 ,调整细胞为0.5-1×10^6/ml。

4、装载探针：按照1:500用无血清培养基稀释JC-1，使终浓度为10ug/mL。

5、孵育探针：37°C细胞培养箱内孵育20分钟，每隔3-5分钟颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触，用无血清的培养液洗涤细胞三次，以去除未进入细胞内的探针。

6、上机检测：流式细胞仪使用激发波长Ex=488 nm，发射波长FL1(Em=525±20 nm)；FL2(Em=585±20 nm)，用Flow Jo软件分析结果。